تثبیت آنزیم لیپاز روی نانوذرات مغناطیسی کیتوسان جهت استفاده در واکنش ترانس استریفیکاسیون

زیست دیزل سوختی سالم، ایمن و زیست تخریب پذیر به عنوان جایگزین مناسب سوخت های فسیلی معرفی شده است. این سوخت از منابع¬ طبیعی و تجدیدپذیر نظیر روغن های گیاهی، روغن های پسماند غذایی، چربی حیوانات و یا از ریزجلبک ها و همچنین ضایعات لیگنوسلولزیک تهیه می¬شود. از لیپازها به عنوان کاتالیزور آنزیمی برای تهیه زیست دیزل استفاده می¬شود. اخیرا برای افزایش نیمه عمر آنزیم و استفاده مکرر از آن، فناوری تثبیت آنزیم بر روی پایه های مختلف بکار گرفته می شود. در سال های اخیر استفاده از نانوذرات مختلف به عنوان پایه برای تثبیت آنزیم مطرح شده است. هدف از مطالعه حاضر، سنتز نانو ذرات مغناطیسی کیتوسان و تثبیت آنزیم لیپاز بر روی آن برای استفاده در واکنش تبادل استری و تولید زیست دیزل است. برای انجام این مطالعه آزمایشگاهی، ابتدا نانو ذره مغناطیسی fe3o4بعنوان هسته سنتز شد و سپس کیتوسان با وزن مولکولی متوسط و با درجه استیل¬زدایی 85% به عنوان پوسته طی مراحلی بر روی آن متصل شد و نانو ذره مغناطیسی کیتوسان سنتز شد. سپس آنزیم لیپاز با استفاده از گلوتارآلدهید و با اتصال کووالان باز شیف بر روی نانوذره کیتوسان تثبیت شد و بوسیله sem و temمورد ارزیابی و تایید قرار گرفت. نقشه برداری دو بعدی و سه بعدی از نانوذرات کیتوسان با afm انجام شد. توزیع اندازه نانوذرات قبل و بعد از تثبیت لیپاز با دستگاه زتاسایزر نشان داده شد و با استفاده از طیف سنجی مادون قرمز (ftir) طیف آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده یررسی و مورد تایید قرار گرفت. فعالیت لیپاز آزاد و تثبیت شده با استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pnpp) بررسی و مقایسه شد. همچنین اثر تغییرات دما و ph بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده بررسی شد. پایداری آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان در دمایc °60 به مدت 2 ساعت بررسی و برحسب فعالیت مخصوص آنزیم محاسبه شد. فعالیت آنزیم لیپاز تثبیت شده در 10 بار استفاده مکرر از آن در شرایط دمایc °40 و 7ph با استفاده از سوبسترای pnpp اندازه گیری شد. همچنین پارامترهای سینتیکی آنزیم لیپازسودوموناس آزاد و تثبیت شده تعیین شد. واکنش تبادل استری با استفاده از آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده برای اولین بار در مقیاس میکرو در میکروپلیت های 96 تایی و با استفاده از شیکر انکوباتور اجرا گردید و برای تایید سنتز زیست دیزل از کروماتوگرافی کاغذی و سپس کروماتوگرافی گازی استفاده شد و آنالیزهای کیفی و کمی مربوط به فعالیت آنزیم و نیز سنجش متیل استر تولید شده در واکنش متانولیز انجام شد. میکروگراف های الکترونی روبشی از نانو ذرات مغناطیسی کیتوسان نشان دادند که ذرات بیضی¬ شکل و یکنواخت می باشند. تصویر afm نشان داد که هیچ ترک مویی و یا ناهمگونی بر روی سطح نانوذرات کیتوسان نمایان نیست. براساس نمودار زتاسایزر توزیع اندازه نانو ذرات کیتوسان سنتز شده در محدوده 15 تا nm 250 قرار داشت و قطر اکثریت این ذرات حدودnm 100 بود و با گراف afmکاملاً همخوانی داشت. ph بهینه لیپاز آزاد سودوموناس 7 و لیپاز تثبیت شده 5/7 بدست آمد. اثر دما بر فعالیت لیپاز آزاد و تثبیت شده درمحدوده 20 تا °c60 در 5/7ph مشخص نمود که دمای بهینه هر دو حالت آنزیم °c40 است و فعالیت مخصوص لیپاز آزاد در این شرایط 13/25 و تثبیت شده iu/mg 43/32 است. درصد فعالیت نسبی آنزیم تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان بعد از بازیافت متوالی و 10 بار استفاده مکرر از آنزیم به 61% رسید. مقادیر پارامترهای سینتیکی براساس معادله لینووربرک به ترتیب برای لیپاز آزاد 07/1 = km و43/29=vmax و برای لیپاز تثبیت شده 29/1= km و82/25= vmax بدست آمد. بالاترین بازده تولید زیست دیزل با استفاده از روغن سبوس برنج توسط لیپاز تثبیت شده novozyme به مقدار ۲۱% و در شرایط مشابه توسط لیپاز آزاد سودوموناس برابر با 57/11% و لیپاز تثبیت شده روی نانوذرات مغناطیسی کیتوسان برابر 48/9% بدست آمد. استفاده از روغن سویا بجای سبوس برنج باعث تغییر بازده تولید زیست دیزل شد که بترتیب برای لیپاز تثبیت شده novozyme به مقدار 67/9%، لیپاز آزاد سودوموناس 35/14% و لیپاز تثبیت شده روی نانو ذرات مغناطیسی کیتوسان برابر 66/9% بدست آمد. با توجه به نتایج نانو ذره کیتوسان حامل مناسبی برای تثبیت آنزیم لیپاز باشد و پایداری آنزیم تثبیت شده در مقایسه با آنزیم آزاد بسیار افزایش می¬یابد. فرآیند تثبیت مقرون به صرفه بوده و برای دفعات متوالی می¬توان از آنزیم استفاده نمود. جداسازی آنزیم بعد از عمل کاتالیز و انجام واکنش به دلیل خاصیت مغناطیسی حامل نانو ذرات مغناطیسی کیتوسان به سهولت امکان پذیر است.